Rekonstitution lyophilisierter Peptide
Vom gefriergetrockneten Pulver zur Stammlösung. Welches Lösungsmittel wofür, wie man ohne Verluste löst und wie man Konzentration und Aliquots berechnet.
Hinweis: Dieser Beitrag fasst publizierte Forschung zusammen. Er ist keine Anwendungsempfehlung und keine medizinische Information. Unsere Produkte sind ausschließlich für Forschungs- und Laborzwecke bestimmt.
Vor dem Öffnen
Das Vial aus dem Gefrierschrank nehmen und verschlossen auf Raumtemperatur kommen lassen. Öffnet man ein kaltes Vial, kondensiert Luftfeuchtigkeit auf dem hygroskopischen Lyophilisat. Das Septum vor dem Anstechen mit einem Alkoholtupfer desinfizieren und trocknen lassen.
Welches Lösungsmittel wofür
| Lösungsmittel | Geeignet für | Nicht geeignet für |
|---|---|---|
| Bakteriostatisches Wasser (0,9 % Benzylalkohol) | Stammlösungen mit Mehrfachentnahme | Zellkultur (Benzylalkohol ist zytotoxisch) |
| Steriles Wasser | Einmalansätze, Zellkultur nach Sterilfiltration | Lagerung angebrochener Lösungen |
| Puffer (z. B. PBS) | Versuche mit definiertem pH | Peptide, die im Puffer ausfallen (vorher testen) |
Semax und Selank sind gut wasserlöslich. Für schwerer lösliche Peptide gelten eigene Regeln, etwa Vorlösen in wenig verdünnter Essigsäure oder DMSO. Für die hier behandelten Peptide ist das nicht nötig.
Arbeitsschritte
- Benötigtes Volumen festlegen, siehe Berechnung unten.
- Das Lösungsmittel langsam an der Glaswand einlaufen lassen, nicht direkt auf das Lyophilisat spritzen.
- Schwenken, bis die Lösung klar ist. Nicht schütteln.
- Sichtprüfung: Die Lösung sollte klar und partikelfrei sein.
- Direkt in Aliquots aufteilen, beschriften (Substanz, Konzentration, Datum, Charge) und einfrieren.
Konzentration berechnen
Die Konzentration ist Masse durch Volumen. 10 mg in 2 ml ergeben 5 mg/ml, also 5 µg/µl. Ein Aliquot mit 250 µg entspricht dann 50 µl. Für molare Konzentrationen durch die molare Masse teilen: 5 g/l ÷ 813,9 g/mol = 6,14 mmol/l Semax. Der Rekonstitutionsrechner übernimmt diese Rechnung, auch für die N-Acetyl-Formen.
Maßgeblich ist der tatsächliche Gehalt laut Analysezertifikat. Lyophilisate enthalten neben dem Peptid Gegenionen und Restfeuchte, der Nettopeptidgehalt kann daher unter der Nennmenge liegen.
Aliquotieren statt wiederholt auftauen
Jeder Gefrier-Tau-Zyklus belastet ein Peptid in Lösung. Deshalb wird die Stammlösung direkt nach dem Lösen in Portionen für jeweils einen Versuchstag aufgeteilt. Dafür eignen sich sterile Leervials. Wie lange Lösungen haltbar sind, steht im Beitrag Lagerung & Stabilität.
Totvolumen und Adsorptionsverluste
Zwischen der berechneten und der tatsächlich verfügbaren Menge liegen zwei systematische Verluste. Der erste ist mechanisch: In Kanüle, Spritzenkonus und am Vialboden bleibt Flüssigkeit zurück. Bei kleinen Volumina summiert sich das schnell auf einige Prozent.
Der zweite Verlust ist Adsorption. Peptide lagern sich an Glas- und Kunststoffoberflächen an, besonders bei niedrigen Konzentrationen unter etwa 10 µg/ml. Bei Stammlösungen im mg/ml-Bereich spielt das kaum eine Rolle; wer daraus stark verdünnte Arbeitslösungen herstellt, sollte den Effekt einkalkulieren. Übliche Gegenmaßnahmen sind Gefäße mit geringer Bindungsneigung und, wo es der Versuch erlaubt, ein Trägerprotein im Puffer.
Sterilfiltration, wenn der Ansatz es verlangt
Für Zellversuche reicht sauberes Arbeiten allein nicht aus. Hier wird die fertige Lösung über einen 0,22-µm-Filter sterilfiltriert. Wichtig ist die Membranwahl: Polyethersulfon (PES) bindet Peptide deutlich schwächer als Nylon oder Celluloseacetat. Bei kleinen Volumina empfiehlt es sich, den Filter mit etwas Lösungsmittel vorzuspülen und das erste Filtrat zu verwerfen.
Prüfliste vor dem Ansetzen
- Vial verschlossen auf Raumtemperatur gebracht?
- Chargennummer mit dem Analysezertifikat abgeglichen und Nettopeptidgehalt notiert?
- Zielkonzentration und Volumen berechnet — notfalls mit dem Rekonstitutionsrechner?
- Passendes Lösungsmittel bereitgestellt? Für Mehrfachentnahmen bakteriostatisches Wasser, für Zellversuche steriles Wasser oder Puffer.
- Beschriftete Leervials für die Aliquots vorbereitet?
- Septum mit einem Alkoholtupfer desinfiziert und getrocknet?
Wenn sich etwas nicht löst
Bleibt nach mehreren Minuten vorsichtigen Schwenkens ein Rückstand, ist meist nicht das Peptid schuld. Häufigste Ursachen sind zu wenig Lösungsmittel, ein Puffer mit ungeeignetem pH-Wert oder ein Vial, das kalt geöffnet wurde und Feuchtigkeit gezogen hat. Semax und Selank sind in Wasser gut löslich; eine trübe oder flockige Lösung ist ein Grund, den Ansatz zu verwerfen und nicht, ihn zu erwärmen oder länger zu schütteln.